ELISA法、免疫印迹法与对流免疫电泳法检测抗ENA抗体的比较

黄文辉　陶怡

【摘　要】　目的　分析比较目前常用的几种检测抗ENA抗体方法的敏感性和特异性。方法　用免疫印迹法(IBT)、酶免法(ELISA)及对流免疫电泳法(CIE)检测130例各种结缔组织病、非结缔组织病人及健康人血清中的抗ENA抗体。结果　20例健康人的血清三种方法检测均为阴性；80例结缔组织病患者，检测抗Sm抗体、抗RNP抗体，IBT法、ELISA法均较CIE法敏感(P＜0.05)。检测抗SS-B抗体，ELISA法较CIE法、IBT法敏感(P＜0.05)。抗SS-A抗体的检测，IBT法由于采用兔胸腺丙酮粉为抗原，SS-A抗原成分有缺失，造成检出率低。IBT法与ELISA法检测的符合率较高。结论　IBT法、ELISA法检测抗Sm抗体、抗RNP抗体时，敏感性优于CIE法。CIE法、ELISA法检测抗SS-A抗体优于IBT法。ELISA法检测抗SS-B抗体敏感性较高。上述三种方法在临床抗ENA抗体的检测中可互相验证和补充。
【关键词】　抗ENA抗体　　酶联免疫吸附试验　　免疫印迹法　　对流免疫电泳

The comparison of ELISA,IBT and CIE in the
detection of anti-ENA antibodies

HUANG Wenhui,TAO Yi.Second Affiliated Hospital,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510260

【Abstract】Objective　To analyse and compare the sensitivity and specificity of the common methods used now in the detection of anti-ENA antibodies.Methods　All 130 serum samples from 80 patients with different connective tissue diseases(CTD),30 with non CTD patients and 20 from normal volunteers were collected and studied.These sera were tested for anti-Sm,anti-RNP,anti-SSA and anti-SSB antibodies with ELISA,immunoblot test (IBT) and current immunoelectrophoresis(CIE) methods.Results　The sensitivity of anti-Sm and anti-RNP antibodies was augmented with IBT and ELISA,such as the detection of anti-SSB antibodies with ELISA.Because the antigens were acetone that come from hare′s chest gland and then the SSA antigens were lacking and sensitivity of anti-SSA antigens was lacking,so the sensitivity of anti-SSA antibodies was the lowest with IBT.IBT was in accord with ELISA.Conclusion　It is suggested that three methods may be complementary in detection of anti-ENA antibodies.
【Key words】　Anti-ENA antibody　　Enzyme-linked immunosorbent assay　　Immunoblotting　　Counter immunoelectrophoresis

　抗ENA抗体检测对结缔组织病的诊断和鉴别诊断具有重要的意义。80年代多采用免疫双扩散法(ID)或对流免疫电泳法(CIE)进行检测，随着分子生物学和酶联免疫技术的发展和应用，免疫印迹技术(IBT)及酶联免疫测定法(ELISA)被较多的用于抗ENA抗体的检测。本文分别用CIE法、IBT法、ELISA法对130例各种结缔组织病和非结缔组织病患者以及正常人的血清标本进行了ENA检测，结果报告如下。

1　材料与方法

1.1　标本来源
　　收集1996年—1997年本院结缔组织病患者80例的血清标本，其中系统性红斑狼疮(SLE)38例，多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)8例，系统性硬化症(SSc)6例，干燥综合征(SS)12例，混合性结缔组织病(MCTD)4例，类风湿关节炎(RA)12例。这些病人都符合国际诊断标准。另任意选择30例非结缔组织病患者和20例正常人的血清作为对照组。
1.2　方法
　　每份血清分别用对流免疫电泳法、免疫印迹法和酶免疫测定法进行抗Sm、抗RNP、抗SS-A、抗SS-B 4种抗体检测。
1.2.1　对流免疫电泳法(CIE)：本法以人脾浸出液为抗原，采用经典方法进行检测。标准血清由华美生物工程公司提供。
1.2.2　免疫印迹法：按许以华等^〔1〕改良法。酶标抗体采用生物素化羊抗人免疫球蛋白和辣根过氧化物酶标化亲和素系统。结果以硝酸纤维膜上显示的蛋白区带与标准分子量和阳性对照进行核对。凡具有28 000/29 000和/或13 500条带的为抗Sm多肽抗体，具有70 000和/或32 000、28 000、29 000、22 000条带为抗RNP抗体；52 000、60 000为抗SS-A/Ro多肽抗体，具有50 000、47 000、45 000者为抗SS-B/La的多肽抗体。
1.2.3　固相酶免疫测定法：聚苯乙烯反应板上微孔用自身抗原包被后，加入血清标本和对照血清孵育反应，孵育期间样品中的抗体结合到固相中。洗涤后，再与稀释好的经辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG孵育反应，经抽吸和洗涤移去未结合的抗体，加入特殊色原，于酶联免疫检测仪波长450 nm处测各孔A值，以测出自身抗体。试剂盒及对照血清均由美国Zeus公司提供。以牛和兔胸腺作为抗原。

2　结　　　果

2.1　本文经过三种检测方法对4种抗ENA抗体检出率的比较，结果证明20例正常人三种方法检测均为阴性，非结缔组织病患者30例中，CIE法均阴性，IBT法检出4例(12.3%)，ELISA法检出3例(10%)。抗Sm抗体阳性率在80例结缔组织病组的检出率用CIE法为7.5%(6/80)，用IBT法为18.8%(15/80)，用ELISA法为15%(12/80)。三种方法抗Sm抗体阳性的绝大多数为SLE患者，仅IBT法检出1例为肝炎。在38例SLE组中，抗Sm抗体的检出率为44.7%(17/38)。抗Sm抗体的阳性率用CIE法为15.8(6/38)，用IBT法为36.8%(14/38)，用ELISA法为31.6%(12/38)，IBT法和ELISA法的敏感性明显高于CIE法(P＜0.05)，而IBT法和ELISA法的敏感性无显著差异(P＞0.05)。CIE法与IBT法、ELISA法检出抗Sm抗体的符合率均是29.4%(5/17)，IBT法和ELISA法的符合率是58.8%(10/17)。
2.2　在80例结缔组织病组患者中，抗RNP抗体的检出率为46.3%(37/80)。用CIE法检出阳性者19例(22.8%)，用IBT法检出阳性者28例(35%)，用ELISA法检出阳性者30例(37.5%)。IBT法和ELISA法的检测敏感性均优于CIE法(P＜0.05及P＜0.01)，而IBT法和ELISA法的敏感性无显著差异(P＞0.05)。CIE法与IBT法、ELISA法检出抗RNP抗体的符合率分别是32.4%(12/37)、40.5%(15/37)，IBT法和ELISA法的符合率是59.5%(22/37)。另外本文4例MCTD患者，三种方法检测抗RNP抗体均为100%阳性。
2.3　80例结缔组织病组患者中，3种方法共检出抗SS-A抗体阳性者51例，用IBT法检出12.5%(10/80)，用ELISA法检出55%(44/80)，用CIE法检出40%(32/80)，ELISA法及CIE法的敏感性明显高于IBT法(P＜0.01)。IBT法测到的抗SS-A抗体均为52 000的多肽抗体。
2.4　抗SS-B抗体的检测，80例结缔组织病患者中，CIE法检出8.6%(7/80)，IBT法检出10.0%(8/80)，ELISA法检出17.5%(14/80)。ELISA法的敏感性较CIE法及IBT法均明显升高(P＜0.05)。三种方法共检出抗SS-B抗体阳性者17例，CIE法与IBT法、ELISA法的检出符合率分别是29.4%(5/17)、35.3%(6/17)、IBT法与ELISA法的检出符合率为35.3%(6/17)。在12例SS的检测中，CIE法与IBT法、ELISA法检出率符合率分别为30%(3/10)、40%(4/10)，IBT法与ELISA法检出的符合率为40%(4/10)。以IBT法检出的均为分子量45 000、47 000多肽。

3　讨　　　论

　　抗ENA抗体是多种结缔组织病诊断的标记，检测技术的发展使我们可以用免疫印迹法和酶免疫法进行ENA抗体的检测，而对流免疫电泳法是传统的较特异的检测方法。本文以三种检测方法的结果进行比较，检测抗Sm抗体、抗RNP抗体，IBT法及ELISA法均较CIE法敏感。IBT法由于采用兔胸腺丙酮粉为抗原，SS-A抗原均为52 000、60 000抗原缺失，因此有一部分抗SS-A抗体漏检，故CIE法和ELISA法检测抗SS-A抗体的敏感性明显高于IBT法，应以CIE法和ELISA法为主。抗SS-B抗体的检测，ELISA法较另外二种方法敏感。在IBT法的检测中，于一条硝酸纤维膜上有数种成分显示，尤其是28 000、29 000的Sm，32 000的U₁ RNP，38 000的γ-RNP等，数种条带相距很近，加上每次电泳时蛋白区带在凝胶中迁移的速率均有不同，以及蛋白区带在电泳时形成的斜率，都给这些条带的识别带来一定困难，很容易造成判别误差和假阳性^〔2〕，本文在IBT检测中也曾遇到过这样的问题。CIE法操作简单、成本低，每一标本均有标准血清作对照，但CIE法敏感性均较IBT法及ELISA法低，在检测时低滴度的抗体容易被漏检。而ELISA法操作简便，每种抗体检测均有标准血清作对照，而且是定量检测，敏感性为三种方法中最高。ELISA法检测的敏感性虽高，但却非常依赖于抗原制品的纯度，抗原的纯化程度影响其检测的特异性^〔3〕。IBT法和ELISA法检出的符合率较高，与两者的敏感性较高有关。

作者单位：510260广州医学院附属二院

参考文献

1　许以华，陈顺乐、叶萍，等.免疫印迹技术检测Sm，RNP及SSB多肽抗体的临床意义.中华内科杂志，1990，29：472
2　甘晓丹，张霞，史艳萍，等.抗ENA抗体检测方法的比较.风湿病学杂志，1996，1：106-108
3　蒋明，陈永铭.风湿病学.北京：科学出版社，1995.356-358

本文编辑：葛虹

收稿：1998-05-06　修回：1999-01-19