类风湿关节炎血清学早期诊断

李小峰　张乃峥　李鸿斌　甘晓丹　唐福林　董怡　崔京涛　张帆

【摘　要】　目的　探索抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗体(AKA)、抗Sa抗体及抗RA33/36抗体检测对R A的早期诊断价值。方法　对未肯定诊断的关节痛/关节炎病人116例 进行上述四种抗体检测并随访观察。APF和AKA用间接免疫荧光法进行检测。抗Sa抗体和抗RA 33/36抗体用免疫印迹法检测。结果　对116例未肯定诊断的关节痛/ 关节炎患者随访4～18个月。APF阳性的29例中，最后确诊为RA 20例(69%)；AKA30例中确诊 RA16例(53.3%)；抗Sa抗体39例中确诊RA 19例(48.7%)。而APF、AKA和抗Sa抗体阴性组中 ，追随后确定为RA者比例不高，而发展为肯定非RA的患者明显高于阳性组，两组比较差异有显著性(P＜0.05)。结论　四种自身抗体均可出现在RA确诊前的 病人中，任何两种以上自身抗体阳性对RA诊断早期有较高的价值。
　　【关键词】　关节炎，类风湿　　抗核周因子　　抗角蛋白抗体 抗RA33抗体　　抗Sa抗体

Serologic diagnosis of early rheumatoid arthritis

LI Xiaofeng ,ZHANG Naizheng,LI Hongbin,et al.Department of Rheumatology Peking Union Medical College Hospital,Beijing 100730

　　【Abstract】　Objective　To explore the diagnost ic value of antiperinuclear factor (APF),antikeratin antibody (AKA),anti-Sa ant ibody and anti-RA33/36 antibody in early RA patients.Methods　One hundred and sixteen unclassified arthralgia/arthritis patients were studied a nd followed up for 4 to 8 months.APF and AKA were detected by indirect immunoflu orescence,anti-Sa and anti-RA33/36 antibodies were detected by immunoblotting. Results　At the end of follow-up,20(69%) out of 29 APF positiv e patients were diagnosed to have RA,16(53.3%) out of 30 AKA positive and 19(4 8.7%) out of 39 anti-Sa positive patients were also diagnosed to have RA.The rates of APF,AKA and anti-Sa negative patients diagnosed to have RA were signif icantly lower than those of serum positive patients.Conclusion　 The 4 kinds of autoantibodies can be detected in early RA patients and have hi gh value on early diagnosis of RA.
　　【Key words】　Arthritis,rheumatoid　　Antiperinuclear factor　 　Antikeratin antibody　　Anti-RA33 antibody　　Anti-Sa antibody

　　类风湿关节炎(RA)的诊断目前主要靠临床表现、X线改变和类风湿因子检测综合判断。到目 前为止还没有一个可作为常规的比较特异的诊断手段，特别是在疾病的早期阶段仍比较困难 ，而早期有效积极的治疗能很大程度上改善RA的预后，至少能延缓病情的进展^［1］ 。类风湿因子(RF)常用于诊断RA，但RF可出现于许多结缔组织病及其他疾病，诊断价值有限 ^［2］。本文对APF、AKA、抗Sa抗体和抗RA33/36抗体进行了研究，由此探讨四种自身 抗体对RA的早期诊断价值，希望能找到一些有助于RA早期诊断的举措，使病人能得到及时诊断和治疗，从而改善病人的预后。

1　资料与方法

1.1　研究对象
　　116例诊断未肯定的关节痛/关节炎患者为1996年至1998年5月北京协和医院门诊或住院病人 ，多为初发病者，有大小关节疼痛和/或肿胀，其中病期多不足1年，不能全部符合1987年AC R的RA分类诊断标准和其他风湿病的常用诊断标准。其中男性29例，女性87例，男女比例1∶ 3，最大年龄73岁，最小年龄16岁，并对这些病人进行长期随访观察。
1.2　方法
1.2.1　APF检测：我们结合Hoet^［3］和Sondag-Schroots^［4］方法对APF 进行检测，简述如下，清洁口腔，取颊粘膜脱落细胞，用PBS漂洗3次，其中第2次加入10 ml 含0.5% Triton-X 100的PBS处置10分钟。调整细胞数至1×10⁸/L，滴至载玻片，风干后 备用。1∶20稀释血清，用间接免疫荧光法检测。判断标准：全片出现2个以上细胞中出现典 型的核周均质圆形荧光颗粒为阳性。
1.2.2　AKA检测：采用间接免疫荧光法^［5，6］，简述如下，取6周龄雄性Wistar 大鼠的中1/3食道作为抗原，冰冻切片，厚度5 μm，－70 ℃保存备用。结果判定标准：典 型的角质层板层状、线状沉积的荧光为阳性。
1.2.3　Sa抗原的制备及其抗体的检测：采用Despres等^［7］的方法，简述如下， 取100 g新鲜的人胎盘组织，匀浆，低温高速离心机4 ℃ 10 000 r/min离心60分钟，取上清 。上清液与DE 52混合，搅拌60分钟，抽滤并用匀浆缓冲液洗涤。将DE 52与300 ml洗脱液A 混合，搅拌60分钟，用700 ml洗脱液A洗涤，弃滤液。DE 52再与300 ml洗脱液B在混合，搅 拌60分钟，抽滤，并用150 ml洗脱液B洗涤，收集滤液。用含0.15 mmol/L PEMSF的蒸馏水 透析24～36小时后冷冻干燥(以上操作均在4 ℃条件下进行)。用免疫印迹法检测，选用5%浓 缩胶、10%分离胶，电泳，样品入浓缩胶前5 mA，进入浓缩胶后提高至10 mA，样品进入分离 胶后改为15 mA。电泳后将抗原转印至硝酸纤维膜上，先后加血清、辣根过氧化物酶标记的 羊抗人IgG抗体和底物液显色。凡在蛋白质分子量为50 000和/或55 000区带出现条带者为阳 性，阳性血清由加拿大Menard教授提供。
1.2.4　RA33/36抗原的制备及其抗体的检测：用Ehrlich腹水癌细胞提取的抗原检测抗RA 33/36抗体^［8］。简述如下，A型玻璃匀浆器破坏细胞膜，保存细胞核，750 g离心5 分钟，取沉淀，弃上清。加入4 ml核悬浮(10 mmol/L pH 7.9 HEPES-KOH缓冲液含有2.5 mmol/L MgCl 25%甘油)，搅拌30分钟，加入4 ml破核液(10 mmol/L pH 7.9 HEPES-KOH缓 冲液含有0.88 mmol/L NH₄Cl)搅拌30分钟，50 000 g离心20分钟，取上清，弃沉淀 。上清液透析24～48小时，分装，－80 ℃冰箱保存。选用5%浓缩胶，12%分离胶电泳，样品 入浓缩胶前5 mA，进入浓缩胶后提高电流至10 mA，样品进入分离胶后改电流15 mA。电泳结 束后，将抗原转印在硝酸纤维膜上。先后加血清、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体和 底物液显色。凡在蛋白质分子量为33 000和/或36 000区带出现条带者为阳性。标准阳 性血清由奥地利Smolen教授提供。

2　结　果

　　我们对随访中的116例诊断未明的关节痛/关节炎患者的APF、AKA、抗Sa抗体和抗RA33/66抗 体阳性和阴性的转归分别进行了分析(见表1、第210页表2)。这些病人经4～18个月随访后， APF阳性的29例中有20例(69%)最后确诊为RA，尚无1例诊断为其他疾病。87例APF阴性患者16 例(18.9%)确诊为RA，1例确诊为SLE，9例确诊SS，6例确诊为OA，确诊为其他疾病的5例。A KA 30例阳性患者中，16例(53.3%)确诊为RA，1例确诊为SS，确诊其他疾病1例。87例AKA阴 性患者中，18例(21.7%)确诊为RA，1例确诊为SLE，9例确诊为SS，6例确诊为OA，确诊为其 他疾病的5例。抗Sa抗体39例阳性患者19例确诊为RA，占48.7%，2例确诊为SS，2例确诊为 其他疾病。76例抗Sa抗体阴性患者17例(22.4%)确诊为RA，1例确诊为SLE，8例确诊为SS，6 例确诊为OA，确诊为其他疾病的4例。对APF、AKA和抗Sa抗体阳性与阴性两组追随后确诊为RA和非RA的机率分别进行卡方检验，阳性组和阴性组间均有显著性 差异(P＜0.05)。抗RA33/36抗体23例阳性患者中10例(43.5%)确诊为RA，2例确诊为SS ，1例确诊为其他疾病。86例抗RA33/36抗体阴性患者中21例(24.4%)确诊为RA，1例确诊为S LE，8例确诊为SS，2例确诊为OA，确诊为其他疾病的5例，对抗RA33/36抗体阳性与阴性两组 随访后确诊为RA和非RA的机率进行卡方检验无差异显著性(P＞0.05)。

表1　APF AKA 抗Sa抗体和抗RA33/36抗体阳性组和阴性组随访后不同转归的分布

表2　四种自身抗体阳性组和阴性组随访后确 诊RA或非RA率的比较

　　为了解未确诊的关节痛/关节炎患者经随访后确诊为RA和非RA患者中四种抗体出现的情况，我们做了进一步的分析(见表3)。36例随访后确诊为RA患者中仅有1例(2.7%)这四种自身抗体中无任何一种，有1种的14例，占38.9%，2种14例，占38.9%，3种5例，4种2例。而确诊为非RA的23例患者中，15例(65.2%)无这四种自身抗体中的任何一种，7例(30.4%)有其中1种抗体，2种的仅1例，3种以上无1例。确诊RA组和确诊非RA组出现四种自身抗体的几率有显著性差异(P＜0.000 1)。

表3　四种自身抗体在未确诊的关节痛/关节炎患者不同转归中的出现率

3　讨　论

　　RA的早期诊断，一直是国内外学者研究的热点。Pekka^［9］等对39例确诊的RA，通过芬兰医疗保险机构查找到病人发病前的血清进行AKA检测。其中10例(26%)为阳性，5例为发病前0～2年，4例为2～4年，大于4年的1例，说明AKA可以在RA发病以前若干年出现。APF同样也可以在RA发病前出现^［10］。Hassfeld^［11］在47例未确诊的关节炎中检测出4例抗RA33/36抗体阳性，对这4例患者进行了8～14个月的随访，最后全部确诊为RA。这一前瞻性研究提示抗RA33抗体可以出现在疾病的起病阶段。Despres也观察到31例病程小于一年的RA患者中有9例抗Sa抗体阳性^［7］。我们对116例未确诊的关节痛/关节炎患者 随访4～18个月，然后对APF、AKA、抗Sa抗体和抗RA33/36抗体阳性和阴性患者的转归进行分 析，结果示APF阳性的29例中有20例(69%)最后确诊为RA，没有1例诊断为其他疾病。87例APF 阴性患者仅16例(18.4%)确诊为RA，比起阳性组的69%要低的多。AKA 30例阳性患者16例(53 .3%)确诊为RA，确诊非RA 2例。87例AKA阴性患者18例(21.7%)确诊为RA，确诊非RA 21例 。抗Sa抗体39例阳性患者19例(48.7%)确诊为RA，确诊非RA 4例。76例抗Sa抗体阴性患者确 诊RA 17例(22.4%)，确诊非RA 19例(25%)。以上资料说明APF、AKA和抗Sa抗体可出现于RA 未确诊前。抗体阳性组经随访一半和一半以上最后确诊为RA，确诊为非RA的为数不多。反之 抗体阴性组确诊为RA的为数不多，确诊为非RA的例数明显增多，阳性和阴性两组转归明显不 同(P＜0.01)，抗RA33/36抗体的情况大致和以上三个自身抗体相同，只是统计学上无 差异，比起以上三种抗体早期诊断意义要差一些。因此得出：其一这些自身抗体可出现于RA 的早期阶段；其二在诊断未明的关节痛/关节炎患者中，自身抗体的阳性有助于RA的早期诊 断。
　　为进一步了解关节痛/关节炎患者中出现的规律，对经随访后确诊的36例RA患者抗体数目进 行的分析发现，仅有1例(2.7%)无任何1种抗体，有1种的14例(38.9%)，2种14例(38.9% )，3种5例(13.9%)，4种2例(5.6%)。而随访后确诊为非RA的23例患者中，15例(65.2%)无 这四种自身抗体之任何一种，7例(30.4%)有其中1种抗体，2种的仅1例，无1例有3种以上抗 体。因此如前所述，在诊断未明的关节痛/关节炎患者中，以1个抗体的出现阳性来判断该患 者是否将来能诊断为RA风险大，而2个以上抗体同时出现把握性要大一些，3个以上抗体同时 出现，几乎可以说100%将来要发展为RA。我们目前随访的未确诊病人中还有3种抗体同时出 现的2例、2种抗体同时出现的10例，是否将来一定发展为RA尚需继续追随，初步认为这些病 人最终发展成RA的可能性很大。
　　总之，APF、AKA、抗Sa抗体和抗RA33/36抗体可出现在诊断未肯定的关节痛/关节炎病人中( 含尚不足以诊断RA，但追随后获确诊的RA患者)，这些患者中自身抗体阳性数越多，随访后诊断RA的可能性越大。尽管很多细节问题尚待进一步研究证实，至少本文提示这些自身抗体 对RA早期诊断有一定价值。因此我们建议四种抗体可作为风湿病学实验室常规检查项目或为减少工作负荷将测APF、AKA和抗Sa抗体检测三者作为常规检查项目。

注释：本课题为卫生部重点学科基金项目(97010205)

作者单位：100730 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院［李小峰(现在山西医 科大学第二医院工作)、张乃峥、甘晓丹、唐福林、董怡、崔京涛］；内蒙古医科大学(李鸿 斌)；黑龙江鸡西矿务局总医院(张帆)

参考文献

　1　Chan KMA,Felson DT,Yood RA,et al.The lag time between ons et of symptoms and diagnosis of rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1993,37:814
　2　Wolfe F,Cathey MA,Roberts FK.The latex revisited rheumatoid f actor testing in 8 287 rheumatic diseases patiants.Arthritis Rheum,1991,34:951[ ZK)〗
　3　Hoet RMA,Borbooms AM,Arends M,et al.Antinuclear factor,a marker autoantibody for rheumatoid arthritis:colcalisaton of the perinuclear fac tor and profilaggrin .Ann Rheum Dis,1991,50:611
　4　Sondag-Tschroots IRJM,Aaij C,Smit JW,et al.The antiperin uclear factor II:the diagnostic significance of the antiperinuclear factor for r heumatoid arthritis.Ann Rheum Dis,1979,38:248
　5　Young BJJ,Mallya RK,Leslie RDG,et al.Antikeratin antibodi es in rheumatoid arthritis.Br Med J,1979,14:97
　6　Vincent C,Serre G,Lapeyre F,et al.High diagnostic value I n rheumatoid arthritis of antibodies to the stratum coreneum of rat oesophagus e pithelium,so-called (antikeratin antibodies).Ann Rheum Dis,1989,48:712
　7　Despres N,Boire G,Menard HA.The rheumatoid arthritis specific Sa autoantigen is present in high concentration in the target tissue(abstr).Art hritis Rheum,1992,35(suppl):S72
　8　Hassfeld W,Steiner G,Harthmuth K,et al.Demonstration of a new antinuclear antibody (anti-RA33) that is highly specific for rheumatoid ar thritis.Arthritis Rheum,1989,32:1515
　9　Pekka K,Kimmo A,Timo P,et al.Antikeratin antibodies prece de the clinical disease.Arthritis Rheum,1992,35:914
10　Aho K,Von ER,Kurki P,et al.Antikeratin antibody and antiperinucle ar factor as markers for subclinical rheumatic disease proccess.J Rheumatol,1993 ,20:1278
11　Hassfeld W,Steiner G,Graninger W,et al.Autoantibody to the nuclea r antigen RA33:a marker for early rheumatoid arthritis.Br J Rheum,1993,32:199

本文编辑：臧长海

收稿：1999-02-10　修回：1999-06-11