流式细胞术检测狼疮患者白细胞
分化抗原40配体

邓安梅　仲人前　施笑梅　陈孙孝　张玲珍　孔宪涛

【摘要】　目的　了解在系统性红斑狼疮(SLE)患者血液中辅助性T细胞(Th)与B细胞间的白细胞分化抗原(CD)40-CD40配体(L)的共刺激作用。方法　用抗CD3单克隆抗体(单抗)刺激SLE活动期和缓解期各10例患者外周血单个核细胞(PBMC)，采用流式细胞术检测不同时段CD40L的表达水平，并与正常对照组比较。结果　活动期SLE组CD40L的表达在抗CD3单抗刺激前后均显著高于正常对照组，差异均有非常显著意义；而缓解期SLE组T细胞在抗CD3单抗刺激前的CD40L表达在正常范围内，在刺激后显著高于正常对照组，差异有非常显著意义。结论　CD40L-CD40共刺激作用在SLE发病机制和病程中起着重要作用。
【关键词】　红斑狼疮，系统性　　流式细胞术　　抗原，CD

Expression and significance of CD40L on PBMC in patients with systemic lupus erythmatosus

DENG Anmei, ZHONG Renqian, SHI Xiaomei, et al.
Clinical Immunology Center, Changzheng Hospital, Shanghai 200003

【Abstract】　Objective　Abstract】　Objective　To investigate the costimulation of CD40L-CD40 between Th and B cell in SLE. Methods　　Stimulated by anti-CD3 monoantibody, CD40L expression on PBMC in patients with active or remission SLE were examined by cytoflowmetry. Results　　CD40L expression in patients with active SLE was increased markedly before/after the stimulation of anti-CD3 mAb. However, CD40L expression in patients with remission SLE was normal before the stimulation and increased markedly after the stimulation of anti-CD3 mAb. Conclusion　　The CD40-CD40L costimulation plays aa important role in the pathogenesis of SLE.
【Key words】　Key words】　SLE　　CD40L cytoflowmetry　　Lupus erythrematosus, systemic　　Flow cytometry　　Antigens, CD

　　系统性红斑狼疮(SLE)是慢性自身免疫性疾病。自身抗原特异性辅助性T细胞通过白细胞分化抗原40(CD40)-CD40配体(L)连接作用于B细胞，从而诱导B细胞活化、增殖，产生从IgM到IgG的病理性自身抗体^［1］，形成免疫复合物沉积于局部，造成器官和组织损伤。辅助性T细胞上的CD40L与B细胞表面的CD40相连接，介导T细胞激活B细胞的信号。CD40-CD40L信号在人类免疫功能调节中起重要作用。我们应用流式细胞术，对活动期和缓解期各10例SLE患者及正常人外周血T细胞在抗CD3单克隆抗体(单抗)前后的CD40L表达进行了分析，以探讨CD40-CD40L共刺激在SLE中的作用。

材料和方法

　　一、观察对象
　　活动期SLE患者10例，平均年龄40岁；缓解期SLE患者10例，平均年龄45岁，20例均为女性。所有患者均符合1982年美国风湿病学会制定的SLE分类标准^［2］。正常对照组20例，取自献血者。
　　二、主要试剂和仪器
　　四甲基异硫氰基若丹明(TRITC)标记的抗CD40L、抗CD25抗体，异硫氰基荧光素(FITC)标记的抗CD3单抗、正常小鼠IgG(Sigma公司)。细菌洗涤液为含2%灭活小牛血清和磷酸盐缓冲液(PBS)0.15 mol/L；含聚乙二醇6000的稀释液40.0 g，用蒸馏水溶解后加至1 000 ml，用G3玻璃滤器过滤，室温保存。流式细胞仪为EPICS型(美国Coulter公司产品)。
　　三、细胞培养
　　患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)经Ficoll-Hypaque液分离，在37℃、5%CO₂中培养，培养基含RPMI-1640，10%小牛血清，160 U/ml青霉素和链霉素。1×10⁶ PBMC在1 ml培养基中单独或与抗CD3单抗共同孵育6、24、48小时。
　　四、流式细胞术分析
　　取1 ×10⁵细胞悬液，分别加入TRITC标记的抗CD40L、抗CD25单抗、FITC标记的抗CD3单抗各20 μl，在对照管中加入正常小鼠IgG 20 μl，混匀后置4℃ 3分钟，用PBS洗3次，弃去上清液，加固定液0.5 ml，尼龙网过滤后进行流式细胞仪分析。
　　五、统计学分析
　　计算出CD40L+细胞所占百分数(%)的平均值和标准差，以及各时段检测的荧光道数值，经t检验进行统计学分析。

结果

　　1.在未经抗CD3单抗刺激时，活动期SLE患者PBMC中CD40L阳性细胞比例(%)比正常对照组显著增高(P<0.01)，而缓解期SLE患者与正常对照组差异无显著意义。在经抗CD3单抗刺激6小时后，3组的CD40L表达均增加，而活动期和缓解期SLE患者均与正常对照组差异有显著意义(表1)。

表1　CD40L阳性细胞在抗CD3单抗刺激前后的比例(%)

　　2.为考察经抗CD3单抗刺激后CD40L表达的动力学，将3组PBMC1×10⁶分别与抗体共同孵育6、24、48小时，而后取1×10⁵细胞悬液经流式细胞仪分析其产生的荧光道数。结果表明，活动期SLE患者PBMC的CD40L表达在经抗CD3单抗刺激6小时后就显著增多，24小时达高峰，到48小时有所下降，但仍然高于正常。而缓解期SLE患者与正常对照组相似，在6小时达高峰，至48小时已逐渐降至近正常。此外，不仅可以看到在刺激后24小时，活动期SLE患者PBMC仍然高表达CD40L，而且在未受抗CD3单抗刺激时活动期SLE患者PBMC的CD40L表达也比正常对照组高。与CD40L不同，活动期SLE患者的CD25(Tac)表达与缓解期SLE患者、正常对照组在48小时时比较相似(表2，3)。

表2　经抗CD3单抗刺激后
三组PBMC的CD40L表达(荧光道数)

表3　经抗CD3单抗刺激后
三组PBMC的CD25的表达(荧光道数)

　　SLE患者体液免疫系统异常激活，在体外实验中，SLE B细胞增殖、产生大量抗体，B细胞体积增大而密度降低，在未受实验性刺激时已表达B细胞活性抗原，对T细胞来源的细胞因子具有高反应性。患者体内形成高γ-球蛋白血症、免疫复合物形成和补体系统激活。SLE患者产生特异性抗原驱动的免疫反应，尤其是胞浆和核内的蛋白质核酸复合物。近来研究表明，随着病情发展，抗原抗体反应的决定簇从早期的较小范围扩展到较大的范围。
　　为研究SLE中Th细胞依赖性B细胞的激活，我们应用流式细胞仪，分析活动期SLE、缓解期SLE患者及正常人PBMC在抗CD3单抗刺激前后的CD40L表达。结果表明，未经抗CD3单抗刺激时，活动期SLE患者PBMC中CD40L的表达比正常对照组显著增高(P<0.01)，这与以前在SLE模型NZB/NZW的F1代小鼠中CD40L水平显著高于正常小鼠的研究结果一致^［3］。不仅活动期，缓解期SLE患者的PBMC对抗CD3单抗刺激均产生高反应。这提示SLE中CD40L表达的调控机制有缺陷。有研究表明，SLE中T细胞的其他信号传导途径也存在缺陷^［4］。我们的结果还表明，SLE患者PBMC的CD40L表达在经抗CD3单抗刺激6小时后显著增多，活动期患者48小时内持续高于正常，不管是以荧光道数计还是CD40阳性细胞比例。而缓解期患者与正常对照组相似，至48小时已接近正常。与CD40L不同，活动期SLE患者的CD25(Tac)表达与缓解期SLE患者和正常对照组在48小时内较相似。体外实验中，CD40L的延长高表达可能反映出体内慢性多克隆T细胞激活，由众多自身抗原激发T细胞。然而CD40L表达的动力学与疾病病程间似无直接联系，患者的基础CD40L更能反映病情。在本组病例中，处于晚期的患者的CD40L较早期患者高。这之间的联系尚待进一步研究。
　　至于SLE中T细胞CD40L增加和延长高表达的细胞机制，我们认为是由于SLE患者中的辅助性T细胞持续、多克隆激活或由于CD40L下调机制缺陷，而非CD40L分子的缺陷。SLE辅助性T细胞可能由记忆性T细胞增殖而来，与天然辅助性T的CD40L表达动力学有所不同。SLE患者中细胞因子水平的改变也可能影响CD40L的表达。有研究表明，B细胞CD40与T细胞CD40L的连接使T细胞表面CD40L减少。又有研究表明，B细胞激活后表达低水平的CD40L。因此，SLE中B细胞CD40的表达和功能对SLE中T细胞CD40L增加和延长高表达有一定作用。
　　已有研究表明，抗CD40L单抗在SLE模型NZB/NZW：F1代小鼠中具有疗效^［5］。我们的结果也认为，CD40-CD40L途径可作为SLE免疫治疗的一条线索。但CD40L表达的失调可能是由于内在缺陷，因此我们尚需进一步探讨SLE中免疫系统的内在缺陷。

本课题受国家自然科学基金资助(编号：39770702)

作者单位：200003，上海第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心

参考文献
　1　Banchereau JF, Bazan D, Blanchard F, et al. The CD40 antigen and its ligand. Ann Rev Immunol, 1994, 12: 881-885.
　2　Tan EM, Cohen AS, Fries JF, et al. The 1982 revised critical for the elassification of system lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 1982, 25: 1271-1273.
　3　Mohan C, Shi Y, Laman JD, et al. Interaction between CD40 and its ligand gp39 in the development murine lupus nephritis. J Immunol, 1995, 154: 1470-1480.
　4　Vassilopouls D, Kovacs B, Tsokos GC. TCR/CD3 complex-mediated signal transduction pathway in T cell and T cell line from patients with SLE. J Immunol, 1995, 155: 2269-2281.
　5　Mary K, Douglas B, Mary KC. Increased expression of CD40L on systemic lupus erythematosus lymphocyte. J Clin Invest, 1996, 98: 826-829.

(本文编辑：臧焰)

(收稿：1998-09-02　　修回：1999-01-31)