肺结核病人特异性抗体分泌水平
及CD23、CD40表达黄 瑾 王 珂 宫肇弟 李淑芳 摘 要 目的：探讨肺结核病人B淋巴细胞活化状态。方法：采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)及细胞－酶联标记法测定了57例活动性肺结核病人特异性抗体分泌水平及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)CD23、CD40的表达。结果：(1)肺结核病人血清抗结素纯蛋白衍生物(purified protein derivation,PPD)抗体IgG、IgM水平明显低于健康对照；病人离体培养的PBMC在无PPD存在的条件下，所产生的IgG抗体明显高于健康对照，而加入PPD后IgG抗体分泌水平与健康对照无差别。(2)肺结核病人当天未经培养的PBMC CD23、CD40的表达明显低于健康对照；病人PBMC经体外培养10 d后，CD23、CD40的表达可明显提高；病人PBMC在加入PPD刺激后，其CD23的表达明显低于未加PPD刺激组，二者存在密切相关。结论：肺结核病人特异性抗体分泌水平降低可能与其B淋巴细胞处于低活化状态有关。
主题词 结核，肺；抗体；CD23抗原；CD40抗原 Observation on the specific antibody and CD23, CD40 expression
in patients with pulmonary tuberculosis HUANG Jin,WANG Ke,GONG Zhao-Di,LI Shu-Fang
Department of Respiratory,2nd Teaching Hospital of Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun(130041) Abstract AIM:Study the activation state of B lymphocytes in patients with pulmonary tuberculosis (TBP).METHODS:The specific antibody and CD23, CD40 expression on peripheral blood mononuclear cell (PBMC) in 57 active TBP were determined by the methods of ELISA and ELISA-cell.RESULTS:1.The serum anti-PPD IgG、IgM levels in TBP were remarkably decreased than that of the controls;The IgG levels produced by PBMC in patients cultured in vitro without PPD are remarkably higher than that of the controls. And in the condition of adding PPD no differences were found between patients and controls,2.Expression of CD23, CD40 on PBMC in patients that weren't cultured were significantly decreased than that of the controls;Expression of CD23,CD40 on PBMC in patients cultured in vitro for 10 days were significantly higher than that weren't cultured;Expression of CD23 on PBMC in patients that was cultured with PPD were decreased than that cultured without PPD,there was a close correlation between them.CONCLUSION:The reason of low levels of specific antibody in patients may be related to the low activation state of B lymphocytes.
MeSH Tuberculosis, pulmonary;Antibodies; CD23 antigens;CD40 antigens 抗结核菌抗体在结核病发生及转归中的作用，一直是人们关注的问题。但其在以细胞免疫反应为主的结核病变中却不占主导地位。其根本原因尚不清楚。CD23、CD40是标志B淋巴细胞活化状态的两种重要的白细胞表面抗原，主要分布于B淋巴细胞表面，可有效地介导B淋巴细胞的增殖、分化及免疫球蛋白的分泌［1，2］。为此，我们选用二者作为观察指标，利用我室建立的细胞－酶联标记法(待发表)，观察了肺结核病人B淋巴细胞的活化状态，以期从更深层次探讨结核病病因。 材料和方法
(一) 对象：所有病例均来自本校二院住院及门诊病人，共57例，男37例，女20例，年龄16～60岁，均为活动性肺结核，未用过激素治疗。诊断按1984年卫生部制定的诊断标准。对照组69例，均来自健康献血员，男38例，女31例，年龄20～45岁。
(二) 试剂：抗CD23单克隆抗体(anti-CD23 McAb)、生物素化羊抗鼠IgG、酶标记亲和素均购自北京军事医学科学院；抗CD40单克隆抗体(anti-CD40 McAb)购自Sigma公司；辣根过氧化酶标记羊抗人IgG、IgM购于北京生物制品所。
(三) 方法：
1.待测血清的采取及PBMC的分离：无菌取静脉血5 mL、肝素抗凝，密度梯度离心后，吸出血清层，－30℃冰箱冻存、待测；同时吸出单个核细胞层，Hanks液洗涤2遍，计数后备用。
2.PBMC的培养：将分离所得的PBMC取1.5×106细胞留当日用，其余细胞数调至1.5×106细胞／孔，置于24孔细胞培养板中，其中1孔加PPD，终浓度为2.5×103 U／L，另设1无PPD培养孔，置于5%CO2、37℃环境中培养10 d，收集上清及细胞，上清冻存备用，细胞留当日用。10 d中未予换液以保证上清中抗体浓度不变。
3.细胞－酶联标记法测定PBMC CD23、CD40的表达：将当日备用及(或)培养后收集的细胞离心、弃上清，在剩余细胞中加入1%戊二醛，4℃冰箱中固定15min。固定后的细胞离心后平分为3管，其中2管分别加入1∶10倍稀释的anti-CD23 MCAb 及anti-CD40 McAb，另1管为空白对照，均置于4℃冰箱中过夜、待测。已过夜的细胞离心后加入1%牛血清白蛋白封闭1h，然后将细胞离心加入1∶1000生物素化羊抗鼠IgG，置于37℃环境中2h，再将细胞离心，加入1∶1000酶标记亲和素，置于37℃环境中2h，将细胞洗涤烘干，试管内加底物缓冲液，移至40孔酶标板中，测OD490nm值。
4.血清及上清中特异性抗PPD抗体的测定。按常规间接ELISA方法。 结 果
一、血清中抗PPD IgG、IgM水平的观察及PPD对PBMC产生抗PPD抗体水平的影响：
活动性肺结核病人血清中抗PPDIgG、IgM抗体水平明显低于健康对照组(表1)。
肺结核病人体外培养的PBMC在未加入PPD时，其IgG抗体分泌水平明显高于健康对照，而加入PPD刺激后，IgG抗体水平与健康对照无差别(表2)，经统计学处理，发现PPD对病人及健康人PBMC产生抗PPD IgM抗体的影响不大。表1 活动性肺结核与对照组血清中抗PPD抗体比较 Tab 1 Comparison of the serum anti-PPD antibody
levels between tuberculosis and control(±s) |