| 心血管疾病中的细胞凋亡 罗义 李卓仁 郭南山 细胞凋亡(apoptosis)或称程序性细胞死亡(programmed cell death)，是细胞在基因活动指导下的主动性死亡。细胞凋亡为普遍存在的一种生物现象，贯穿于机体整个生命活动过程的基本生理机制，调节着机体细胞增殖与更新间的平衡，维持组织器官正常生理功能及细胞数量的稳定。某些致病因子可以使细胞凋亡的基因调控失常，致使细胞凋亡减弱或增强，从而破坏了机体细胞的自稳态，最终表现为疾病的发生［1］。近年细胞凋亡已成为心血管疾病研究中的一个热点，现就此问题进行综述。
一、细胞凋亡的形态学、发生机制和调节因素［1～3］
细胞凋亡与坏死是生物细胞死亡的两种截然不同方式。细胞坏死(necrosis)是指由病理刺激导致的被动性细胞死亡，其过程无基因调控参与。受累细胞常呈灶状、成群发生，细胞核固缩，DNA无规律地裂解成碎片，电泳呈连续带(smear)，细胞膜溶解、线粒体和溶酶体破坏并有酶漏出，最后整个细胞崩解、破碎，伴炎症反应，无凋亡小体形成。细胞凋亡由病理刺激或生理刺激引起，是主动性细胞死亡，其过程由基因调控。受累细胞呈散在、单个发生，细胞核固缩，染色质密度增高并聚集在核膜周边，DNA裂解为180-200 bp及其倍数的寡核苷酸片段，琼脂糖凝胶电泳中呈梯状带(ladder pattern)，细胞浆固缩，胞膜内陷将细胞分割为多个外有膜包裹、内有完整细胞器的小体，即凋亡小体(Apoptotic bodies)。多数小体含有核成分，凋亡小体被临近的巨噬细胞或组织细胞吞噬，无细胞膜溶解、线粒体和溶酶体破坏和酶漏出，不出现炎症反应。
细胞凋亡的机制尚未完全阐明，目前认为其基本过程是细胞在凋亡信号刺激下，通过信号传递通路，使凋亡调控基因表达发生改变，进而在某些离子如Ca2+和Mg2+参与下激活某些酶而启动细胞凋亡。如核酸内切酶使DNA在核小体联结子部位断裂，钙蛋白酶破坏细胞骨架而使细胞皱缩，谷酰胺转移酶使胞浆内蛋白质交联。
细胞凋亡受多种体液因子和细胞因子调节，主要有：影响细胞增生的激素和生长因子，如促凋亡因素有糖皮质激素、转化生长因子-β(TGF-β)和表皮生长因子(EGF)，抑凋亡因素有血管紧张素Ⅱ、神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)和血小板源性生长因子(PDGF)等；影响细胞内Ca2+浓度和第二信使的因子，如前列腺素E2和钙离子载体等；某些细胞表面蛋白或细胞粘附分子的配体，如抗APO-1/Fas抗体和抗CD3/TCR抗体；某些细胞因子，如白细胞介素、α-干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)。细胞凋亡的基因调控十分复杂［3］，目前已知主要的促凋亡基因有Bax、wp53、APO-1/Fas等，主要的抗凋亡基因有Bcl-2、mp53、ras、Bcr/Abl等，而c-myc则具有促进细胞增殖及诱导细胞凋亡的双重作用。当有血清、生长因子和丝裂原等存活因子存在时，c-myc促进增殖，反之则诱导凋亡。各基因间还存在正、负调节和相互作用，血管平滑肌细胞(SMC)凋亡的调节存在p53依赖型和p53非依赖型两条途径，c-myc基因诱导的细胞凋亡是p53依赖型的，而Bcl-2基因抗细胞凋亡是p53非依赖型的。
二、细胞凋亡与动脉粥样硬化和冠心病
1.动脉粥样硬化(AS)：近年研究认为，细胞凋亡在AS的发病中可能起着重要作用。Geng和Libby［4］用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP生物素断端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labelling，TUNEL)法检测人AS冠状动脉和颈动脉，发现病变内膜中TUNEL阳性细胞数(34±6%)明显高于无病变的内膜(8±3%)，AS斑块中可检出寡核苷酸片断，而无AS的血管未检出此种片断，表明AS病变中有细胞凋亡发生。Han等［5］观察35例人AS冠状动脉标本，25例证实有细胞凋亡。Isner等［6］报道人原发性AS病变中细胞凋亡检出率冠状动脉为29%，周围动脉为43%。动物实验也证明AS斑块中有细胞凋亡发生。
用TUNEL分析结合细胞种类特异性标志免疫染色法研究证实［4，5］，AS病变中凋亡细胞多数是SMC和巨噬细胞。Hegyi等［7］研究发现，人AS病变的脂质核心周边有泡沫细胞坏死和凋亡，脂质核心内有凋亡细胞核残余物，某些TUNEL阳性细胞还显示有增生细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)，提示AS发病中某些细胞的增殖和凋亡活性都是增高的。原发性AS病变中细胞数较少而凋亡小体较多，提示脂质核心的形成可能是细胞凋亡活性大于增殖活性的结果。这些研究表明，细胞凋亡可能是AS病变中细胞死亡的主要方式，SMC凋亡失调和凋亡小体清除不足可能是加剧AS发展的重要因素。AS病变中细胞凋亡发生率虽然较低，但可致细胞数减少并贯穿于整个病变发展过程中。纤维帽中细胞凋亡增加可降低斑块稳定性而致急性临床事件发生。
AS病变中细胞凋亡的发生机制未明。C-myc基因表达失调是SMC增殖和凋亡的主要因素之一。AS斑块中SMC的c-myc基因表达增高而Bcl-2基因表达不足。用逆向转录酶多聚酶链反应证实AS病变表达白细胞介素-1β转化酶(ICE)的mRNA，免疫组化分析显示ICE存在于TUNEL阳性的SMC和巨噬细胞，提示AS病变中细胞凋亡的发生可能与ICE表达增加有关［4］。IGF和PDGF是SMC的强效存活因子，这些因子缺乏可导致SMC凋亡。Bennett等［8］发现，人的正常冠状动脉和主动脉SMC仅在去除血清生长因子后才发生凋亡，而AS斑块中的SMC即使在高血清状态下也发生凋亡，去除血清后则凋亡发生加剧，说明血清生长因子缺乏只是AS斑块中SMC凋亡的部分原因。bFGF缺乏和TNF则可引起血管内皮细胞凋亡。氧化型低密度脂蛋白在体外能诱导巨噬细胞发生凋亡，可能是AS病变中泡沫细胞死亡的原因之一。
2.血管再狭窄(RS)：人血管成形术后RS病变中细胞凋亡检出率很高［6］，冠状动脉为86%，周围动脉为93%。动物血管损伤模型也证实新生内膜中有凋亡细胞［9］。大鼠主动脉去内皮15天后，病灶中发现大量凋亡的SMC，其数量于损伤后20天达最多，到45天后损伤处内皮重新愈合时，凋亡的SMC随之消失。RS病变中细胞数较多而凋亡小体较少，病变中凋亡小体密度与内膜细胞数呈显著负相关。上述研究表明：SMC凋亡是调节内皮损伤所致内膜增厚演变的一个重要机制。细胞增殖活性越高，则所伴随的细胞凋亡活性也越高，两者的动态平衡才能维持细胞数稳定。细胞增殖活性上调和(或)细胞凋亡活性下调或两者同向变化，因程度不同而致增殖-凋亡失平衡，可能是RS发生的重要机制。
实验显示，新生内膜的SMC有c-myc基因上调，wp53蛋白在30%血管成形术后RS部位出现过度表达，提示新生内膜中c-myc上调可能激活wp53，通过p53依赖性通路诱导细胞凋亡。
3.急性心肌梗塞(AMI)和缺血-再灌注损伤(IRI)：近年研究证实，AMI的梗塞区及其周边区有细胞凋亡发生。Bardales等［10］用原位细胞凋亡分析技术检测80例心脏组织切片，发现常规苏木素和伊红染色的病理组织学检查尚不能作出明确诊断时，DNA断裂原位分析就已检出心肌细胞缺血性死亡。大鼠冠状动脉阻断后3小时梗塞周边区心肌中即可检出细胞凋亡，直至1个月仍可检出［11］。定量分析显示，冠状动脉阻断后1～2天梗塞区细胞凋亡发生达高峰，以后逐渐降低，14天后维持在一个相对稳定的水平，而远离梗塞区的心肌其细胞凋亡一直保持在一个恒定的低水平。Kajstura等［12］研究认为，细胞凋亡是AMI时心肌损伤的主要形式，而细胞坏死是随后发生的。
已有报道，IRI的发生与细胞凋亡密切有关。Gottlieb等［13］在家兔离体心脏灌注模型上发现，缺血5分钟后再灌注4小时、缺血30分钟、缺血4.5小时的心脏均无心肌细胞凋亡发生，而缺血30分钟后再灌注4小时的心脏出现心肌细胞凋亡，说明心肌细胞发生凋亡不但要求缺血达一定的时间，而且再灌注是促使凋亡发生的因素。另有研究则发现，持续缺血的心肌和缺血后再灌注的心肌均有细胞凋亡发生，再灌注可以减少发生凋亡的心肌细胞数，但却使不可挽救的心肌细胞加速发生凋亡。业已证实，AMI和IRI中发生凋亡的细胞主要是心肌细胞和巨噬细胞。
AMI及IRI中细胞凋亡的机制还不十分清楚。Suzuki等［14］研究发现，冠状动脉结扎5小时，梗塞区心肌细胞即呈现TUNEL阳性染色，第2～3天渗入梗塞区的巨噬细胞也呈现阳性染色，出现DNA断裂，而且与诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性增高相一致。先用S-甲基异硫脲硫酸盐(s-methylisothiourea sulfate)抑制iNOS可明显增加局部心肌血流和改善左室功能。因此推测iNOS生成增多可能是心肌细胞和巨噬细胞凋亡的机制。研究显示，AMI中细胞凋亡伴有Bcl-2表达降低而Bax表达增加，认为心室机械负荷可能影响此两个基因对存活心肌细胞的调节［11］。动物实验发现，AMI心肌细胞中Fas蛋白表达增加131倍［12］，体外培养的新生大鼠心肌细胞在缺氧12小时后出现DNA降解片段，心肌Fas的mRNA上调2倍，提示心肌细胞缺血坏死与Fas介导的细胞凋亡有关。Wp53表达增加和TNF可能也参与了心肌细胞凋亡的发生机制。细胞内Ca2+超负荷是IRI的一个重要发病机理，而Ca2+是多数细胞凋亡的触发剂。
以上研究提示：凋亡是AMI和IRI中心肌细胞死亡的重要形式，细胞凋亡的发生可能与抗凋亡基因/促凋亡基因表达失衡、细胞因子和体液因子等有关。AMI和IRI中有细胞凋亡发生，这一事实为治疗AMI时怎样保护心肌开拓了新思路。
4.缺血预适应(IPC)：IPC通过蛋白激酶C(PKC)信号系统来保护心肌，防止其梗死。此保护效应的特征是伴有细胞内酸化减低。胞内酸化是细胞凋亡的一个特征，某些药物通过激活细胞离子通道和离子泵减低胞浆酸化，从而具有抗凋亡作用。Gottlieb等［15］发现，IPC能提高鼠心肌细胞存活力，减轻代谢抑制所诱发的细胞内酸中毒，减少DNA断裂，而阻滞空泡质子ATP酶(vacuolar proton ATPase)则可消除IPC的这些作用，因此认为在介导IPC中PKC的目标是激活空泡质子ATP酶，继而在持续缺血导致代谢抑制时减轻细胞内酸化，从而抑制细胞凋亡。抑制ICE也有助于减轻代谢抑制引起的心肌细胞损害。此外，IPC能降低缺血边缘区TNFα表达，有可能阻止缺血细胞发生凋亡。因此推知，IPC的心肌保护效应部分可能是通过抑制细胞凋亡实现的。
三、细胞凋亡与其他心血管疾病
1.高血压病：Hamet等［16］报道遗传性高血压病鼠的心、脑、肾组织中实质细胞凋亡增多，凋亡诱导剂对自发性高血压病大鼠(SHR)主动脉SMC的作用明显强于正常血压鼠，提示原发性高血压病的发病和高血压所致靶器官损害的机制可能与细胞凋亡有关。心脏压力负荷增加可诱发心肌细胞凋亡增加，随后发生心肌肥大，说明凋亡可能参与高血压心室重构的发病过程。Losartan和硝苯地平可刺激SHR肥厚血管壁的SMC发生凋亡而使血管肥厚消退。Diez等［17］发现SHR心肌内小动脉SMC中Bcl-2过度表达，用喹那普利治疗后Bcl-2表达降至正常而Bax表达明显增加，提示Bcl-2/Bax平衡失调可能是高血压病血管SMC凋亡失衡的机制。
2.心肌病和心肌炎：扩张型心肌病心肌中可检出病毒染色体组RNA，表明心肌病与病毒性心肌炎之间存在密切关系。病毒感染可引起细胞因子和Fas表达，iNOS生成增多，激发心肌细胞发生凋亡［18］。原发性心肌病终末期心衰患者心肌中脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNAaseⅠ)水平升高，快速起搏心室导致的扩张型心肌病狗心肌中Fas表达增加，心肌细胞凋亡增加［19］。这此研究提示，心肌细胞凋亡可能是心肌病中心肌细胞数减少的主要机制，病毒性心肌炎可能是通过激发心肌细胞凋亡进而发展成心肌病的。
3.心律失常：James［20］用电镜观察了从反复发作室性心律失常伴晕厥的长QT综合征患者切除下来的窦房结，发现有典型的细胞凋亡，认为其心律失常反复发作可能是细胞凋亡反复发生所致。房室交界区组织的细胞凋亡在维持心电稳定方面起有益作用，但如果细胞凋亡过度或不足则会起有害作用。房室结的残存性胎块(persisting fetal pocket)退化清除不全可能使残留的肌细胞具有异常高的兴奋性而产生自律性心律失常；房室结边缘的环连接未退化消除(此情况称残存性胎裂片，persistent fetal dispersion)可能就是形成折返激动的物质基础，预激综合征的情形与此雷同。胎儿出生后如果房室结组织退化消除过度，则会导致正常房室传导途径的中断。窦房结或窦房交界区细胞凋亡过度则会导致病窦综合征。有人观察到，心律失常患者致心律失常的内膜下心肌有凋亡现象。可见，细胞凋亡失平衡可能是某些心律失常的发病基础。
4.心力衰竭：心肌细胞凋亡参与心衰的心肌重构，这是心衰发病学上的新观点。在扩张型心肌病和缺血性心脏病的充血性心衰患者和动物均已证实有心肌细胞凋亡。心肌细胞凋亡使心肌细胞数目逐渐减少，纤维化进行性加重，从而心功能不全进行性发展。
总之，动物实验和人体研究均已证实多种心血管疾病中存在细胞凋亡，但细胞凋亡是疾病的原因还是结果，是发病机制还是伴随现象，其重要性究竟如何，目前尚不够明确。细胞凋亡的发生机制和各种调控细节，迄今也远未阐明。对这些问题进行深入研究，有可能为探索心血管疾病的发病机制和防治方法开辟一条崭新的途径。 作者单位：510180 广州市第一人民医院心内科 参考文献 1 Carson DA, Ribeiro JM. Apoptosis and disease. Lancet, 1993, 341: 1251-1254.
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(本文编辑：丁云秋) |